基于拓扑异构酶（Toposiomerase）的克隆（TOPO cloning），是一种利用A和T碱基互补配对的DNA克隆方法，不依赖于限制酶和连接酶。TOPO克隆不仅适用于粘性末端的克隆，同样适用于平头末端克隆。拓扑异构酶I，存在于细胞核内，参与调控DNA的拓扑结构，调节超螺旋模版。

TOPO克隆的机制涉及PCR产物“A”末端的形成，以及拓扑异构酶I在线性化骨架的“T”末端作用。Taq酶在PCR扩增后，会在产物3'末端留下脱氧腺苷酸，而拓扑异构酶I识别特定序列并在此处酶切双链DNA。断裂DNA释放的能量储存在3'末端和酪氨酸残基之间的共价键中。市面上的TOPO试剂盒为载体或克隆臂提供了含3'脱氧胸腺嘧啶核苷的“A”突出末端。

在TOPO技术中，牛痘病毒中的拓扑异构酶I被分离并用于识别特定序列，切割双链DNA。这些试剂盒中的载体在半乳糖苷酶盒中插入拓扑异构酶识别位点，允许通过蓝白斑筛选转化后的载体，但并非所有蓝色菌落都是阳性菌落，因为自连接产生的蓝色菌落可能并非阳性克隆。引入含“A”的插入片段后，TOPO克隆便能完成。

TOPO克隆步骤包括合成PCR产物、配置TOPO克隆反应体系、室温孵育5分钟、转化、以及单克隆鉴定。PCR产物合成时需设计标准引物，无须添加5'磷酸，确保自由羟基基团存在。PCR扩增后，增加延伸时间以确保“A”添加到所有产物上。使用Taq酶扩增时，存在约1/3500的错误率，可通过使用校对聚合酶或混合校对酶与Taq酶，以及Gel纯化PCR产物后孵育于72℃来降低错误率。同时，在混合PCR产物和TOPO载体时，需添加盐以防止拓扑异构酶I重新结合。

实验要点包括PCR产物的5'磷酸去除、Taq酶的使用、校对酶的添加、盐的加入，以及孵育时间的控制。实验前应充分准备，包括预热抗平板，以在8小时内观察到菌落生长。参考书籍《Plasmids 101：A Desktop resource —— Created and Compiled by Addgene March 2024（3rd Edition）》提供详细指导。