两小无猜正九开最佳生肖是马。

首先，我们来解析一下“两小无猜正九开”这个谜语。在中国传统文化中，九是一个吉祥的数字，象征着长久和繁荣。而“正九开”可能隐含着正月九日开始的意思，也就是农历新年的第九天，通常在中国文化中，这一天被认为是马的生日，因此与生肖马有了关联。

进一步从文化和象征意义上来解读，马在中国文化中一直是活力、自由和奔放的象征。这与“两小无猜”的意境相呼应，表达了一种无忧无虑、天真烂漫的童年情谊。马作为生肖，不仅代表了力量和速度，还寓意着勇往直前、不断追求的精神，这与孩子们纯真的性格和对未知世界的好奇探索相契合。

此外，“两小无猜”这个词语本身描绘的就是两个小孩之间纯真无邪的友谊，没有猜疑和算计。而马作为生肖，常被赋予热情、开朗的性格特点，这与“两小无猜”所表达的情感状态不谋而合。因此，结合谜语中的“正九开”和生肖的象征意义，马作为最佳生肖答案是合情合理的。

综上所述，通过对谜语的文化解读和生肖象征意义的分析，我们可以确定“两小无猜正九开”的最佳生肖是马。这不仅因为马与农历新年的第九天有关联，还因为马所代表的文化意象与“两小无猜”的情境高度契合，展现了孩子们天真烂漫、自由自在的精神风貌。